文章來源：知識分子微信公眾號
? 加州大學伯克利分校的分子生物學家Jennifer Doudna是最早發現CRISPR-Cas9的科學家之一。Credit：Cailey Conner，加州大學伯克利分校
“基因魔剪”CRISPR-Cas系統因其操作簡便、靶向精準等特點已經成為全球各大實驗流行的基因編輯技術。12月23日凌晨，《自然》（Nature）在線發表一項研究“來自非培養微生物的新的CRISPR-Cas系統”（New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes），報告了兩種新的CRISPR-Cas基因編輯系統：CRISPR–CasX 和CRISPR–CasY。這項發現來自于加州大學伯克利分校地質微生物學家吉利安·班菲爾德（Jillian F。 Banfield）和分子生物學家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）兩個實驗室的聯合研究。
詹妮弗·杜德納是最先發現CRISPR-Cas這一技術的科學家之一，但CRISPR-Cas的專利歸屬一直存在爭議。值得注意的是，針對此次論文中的最新發現，詹妮弗等人已向美國專利及商標局提交了臨時專利（provisional patent）申請。臨時專利申請是在最后或完全的申請完成前向專利局遞交的一種臨時或過渡申請。其規定所針對的對象主要是已經脫離基礎理論階段，具有應用前景和潛在商業價值，但還不能申請專利的成果。如果一項成果的應用前景還不明朗，可以先申請臨時專利，待進一步研究后再申請正式專利。
? 吉利安·班菲爾德（Jillian F。 Banfield）在科羅拉多采集數據，CRISPR-CasX系統便發現于她采集到的細菌中，Roy Kaltschmidt 于2014年拍攝，來源：berkeley.edu
CRISPR–Cas系統中的核心成員之一是Cas （即CRISPR associated protein），它是一種切割DNA的酶，是“基因魔剪”中的剪刀。
? RNA介導的CRISPR-Cas9系統定向基因組修飾作用機制示意圖。Cas9內切酶是一種DNA內切酶，很多細菌都可以表達這種蛋白，Cas9內切酶能 夠為細菌提供一種防御機制，避免病毒或者質粒等外源DNA的侵入。 利用Cas9內切 酶家族來靶標和剪切外源DNA的II型CRISPR/Cas免疫系統來進行有效的靶向酶切。 Cas9內切酶必須在向導RNA分子的引導下對DNA進行切割，這是因為這些向導RNA 分子含有與靶DNA序列互補的序列，稱之為PAM序列。 Cas9內切酶在向導RNA分子 的引導下對特定位點的DNA進行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會借助同源重 組機制（homologous recombination）或者非同源末端連接機制（non-homologous end joining）對斷裂的DNA進行修復。如果細胞通過同源重組機制進行修復，會用另外一 段DNA片段填補斷裂的DNA缺口，因而會引入一段新的“遺傳信息”，從而實現基因的編輯。圖片選自上海南方模式生物研究中心。圖片原始來源：http://www.nature.com/nature/journal/v495/n7439/full/495050a.html
目前人們在細菌中發現了很多Cas酶，其中最常用的來自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）。不同來源的Cas酶，其特性也不盡相同，雖然目前的CRISPR-Cas系統已相當成熟而強大，但是人們還是希望找到更多的Cas酶，以發掘更多的應用潛力：如尋找更小的Cas酶，因為現在使用的Cas酶是較大的蛋白，將其轉入細胞中較為困難；再比如，Cas酶的作用需要依賴PAM（protospacer adjacent motif）的短DNA 序列，如釀膿鏈球菌中的Cas9酶需要識別的序列是NGG等，這在一定程度上會限制Cas9的基因編輯范圍，而發現更多的Cas酶，則意味著可以識別更多的PAM序列，擴展基因編輯的范圍。
我們知道Cas酶來自于細菌，而人類真正培養和認識的細菌非常有限，還有更多的細菌在我們生活的環境中，不為人所知。因此，研究人員決定直接從地下水、土壤、嬰兒腸道、酸性礦坑水等富含各種微生物的環境中取材，雖然研究者們不能培養這些微生物，但是卻可以獲得它們的宏基因組信息，將這T數量級（terabase-scale）的宏基因組信息與CRISPR和Cas1序列進行類比。功夫不負有心人，研究者們發現了兩類新型的CRISPR–Cas系統，并將其命名為CRISPR–CasX 和CRISPR–CasY，其中CasX蛋白約有980個氨基酸、CasY蛋白約有1200個氨基酸，它們是目前已知最小的CRISPR–Cas系統，因此具有巨大的基因編輯潛力。
隨后，研究者們在大腸桿菌（E。 coli）中對這兩類CRISPR–Cas系統進行了功能檢測，發現他們在特定的tracr gRNA的引導下，均可以與目標DNA相互作用。但是，研究者沒有進行更深入的DNA切割、哺乳動物細胞等驗證。
此外，研究人員還在古菌域中首次發現了Cas9。而過去學術界一直認為古細菌沒有此類基因編輯系統，這大大更新了人們對這一系統的認識。
? 采集加利福尼亞州Crystal Geyser深層地下水中的微生物，CRISPR-CasY系統就是在這里發現，Jill Banfield 拍攝，來源：berkeley.edu
以CRISPR-Cas系統為代表的基因編輯技術可以實現對DNA片段的敲除、加入等，現在，以及可預計的未來，在生命科學基礎研究、基因治療等醫學領域將有極大的應用潛力。因此，圍繞CRISPR-Cas系統的專利爭奪的也非常激烈。
2012年6月28日，詹妮弗·杜德納實驗室在《科學》（Science）在線發表論文，報告利用CRISPR-Cas9系統在體外實驗中，實現了對DNA序列的編輯； 2013年1月29日，杜德納實驗室將這一技術成功應用在人類細胞中的論文發表在Elife上。而美國麻省理工學院博德研究所的張鋒實驗室已將這一系統應用在人類細胞上的研究論文，并在2013年1月3日在線發表于《科學》。通過繳納專利快速審核費用，張鋒率先拿到了CRISPR-Cas9系統應用于哺乳動物細胞的專利。加州大學伯克利分校后提起訴訟，以爭奪這一專利的歸屬權。目前，美國專利商標局尚未做出最終裁決。
（致謝：感謝陸宗陽對文章內容的討論）
參考資料：
1。 New CRISPR–Cas systems from uncultivated microbes。 Nature （2016）。 doi：10.1038/nature21059
2。 Marraffini L A。 The CRISPR-Cas system of Streptococcus pyogenes： function and applications[J]。 2016。
3。 Compact CRISPR systems found in some of world’s smallest microbes：http://news.berkeley.edu/2016/12/22/compact-crispr-systems-found-in-some-of-worlds-smallest-microbes/
4。 基因魔剪專利之爭現新變數？杜德納發現新“剪刀”并申請專利：http://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_1585675
5。 Biotechnology： Rewriting a genome：http://www.nature.com/nature/journal/v495/n7439/full/495050a.html
6。 http://www.wipo.int/sme/zh/documents/prov_application.html
本文標題：《自然》快速評審：“基因魔剪”家族添新成員
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