文章來源：醉心科學微信公眾號

　　繼20名中外學者在Protein Cell雜志發表實驗數據表明無法重復韓春雨的論文（以下簡稱韓論文）實驗結果之后，發表NgAgo原始論文的Nature Biotechnology （自然生物技術，NBT）雜志也在幾天前發表了一篇經過同行評議（peer reviewed）的名為“無法檢測到DNA介導的NgAgo基因編輯”（“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute” ）的論文，作者分別來自于韓國、德國、以及美國的三個具有豐富基因編輯研究經驗的研究組。雜志同時配發了“編輯部關注”，表示對于韓論文的可重復性的憂慮，同時表明會與原論文作者保持聯系，在2017年一月底之前完成調查。眾多媒體已經就“編輯部關注”進行了大量報道，在這里我給大家詳細說明一下這篇重復NgAgo基因編輯失敗的學術論文的實驗設計和結果。

　　這三個研究組分別獨立得進行了韓論文的重復實驗，合成了文中使用的具有5’磷酸化的gDNA（guide DNA，在韓論文描述中可以介導NgAgo到目標基因位點進行編輯），使用韓提供給Addgene（質粒共享的平臺）的NgAgo表達質粒，轉染了韓論文中使用的細胞系，對于基因組DNA的編輯進行了檢測。如果NgAgo發揮作用，它將在gDNA的介導下，定位在目標基因組位點并引發DNA的雙鏈斷裂，進而導致目標位點發生小片段DNA的插入或缺失突變（insertion and deletion， indel）。盡管多次嘗試并試圖優化條件，這三個研究組都無法檢測到任何內源基因發生了NgAgo介導的突變。

　　首先Cathomen研究組試圖重復韓論文中在Hela和293T細胞中利用NgAgo編輯質粒上的GFP（綠色熒光蛋白）基因，從而降低GFP表達的實驗。盡管使用了同樣的實驗系統和步驟，使用了韓論文中使用的gDNA（G3、G4），Cathomen研究組未檢測到顯著的GFP降低。

　　圖中表明的是質粒表達GFP的降低水平。可見使用CRISPR系統（Cas9）的樣品中具有明顯的GFP表達降低（約15倍），而NgAgo組無論是使用韓所提供的Addgene質粒（AgoN1）還是他們自己克隆的質粒（AgoN2），均未能檢測到GFP降低。

　　他們進一步嘗試編輯整合在基因組里面的GFP基因，同樣未能發現GFP表達的顯著降低。

　　Ekker研究組在HEK293、Hela和K562細胞中檢驗了NgAgo對于內源基因DYRK1A的編輯，使用了韓論文中使用的五條gDNA（G5、G6、G10、G12和G13）。在所有的樣品中都沒有檢測到目標基因發生突變。

　　I部分標明這五條gDNA在目標基因上所處的位置。II部分是DNA的測序圖，每一個顏色的峰表示一個DNA的堿基（紅色T，綠色A，藍色C，黑色G）。可見無論用那一條gDNA和NgAgo一起進行實驗，測序結果都和普通未編輯的細胞一樣，意味著沒有基因編輯被檢測到（ DNA序列未發生改變）。

　　Kim研究組針對韓論文中的四個內源基因位點（DYRK1A， EMX1， GATA4， and GRIN2B）都進行了編輯實驗，并且嘗試了用脂質體轉染和電穿孔轉染兩種方法將NgAgo表達質粒和gDNA導入細胞中。 不同樣品中的基因組目標位點被擴增出來并應用深度測序來確定其發生突變的頻率。在所有的NgAgo樣品中都未能檢測到高于測序誤差（0.1%）的目標位點DNA序列變化，而作為陽性對照的CRISPR樣品（SpCas9， sgRNA）則檢測出高效率的基因編輯。下圖只挑選了兩個位點的數據進行展示。

　　圖中標明的是在293T細胞中分別用脂質體轉染（紅色柱狀圖）和電穿孔轉染（綠色柱狀圖）導入質粒和gDNA的實驗結果。最上面的兩個樣品是CRISPR的陽性控制組，顯示質粒可以被有效的導入細胞發揮作用，CRISPR系統可以有效的在目標基因位點產生突變。下面的樣品分別是使用他們自己克隆的NgAgo（cloned NgAgo 200ng）以及Addgene上面韓提供的質粒（Addgene NgAgo 200ng），結合不同gDNA共同轉染的樣品，均未能在目標位點檢測到突變。

　　Kim研究組應用質譜分析技術確定了所使用得gDNA確實具有5‘磷酸化，并且應用熒光標記的gDNA和表達GFP的質粒確定了gDNA和NgAgo質粒被有效得轉染進入細胞。其他的兩個研究組也應用Western blot和RT-PCR手段確認了NgAgo在被轉染細胞中的有效表達。

　　綜合所有這些數據，這三個研究組的結論是“基于以上數據，我們的結論是，將NgAgo表達質粒和5’磷酸化的gDNA共同導入人類細胞系是無法得到韓論文中的突變效率的。”（“On the basis of the above data， we conclude that in conditions designed to replicate those in Gao et al.3， co-delivery of plasmid DNA encoding NgAgo and a 5?-phosphorylated single-strand gDNA alone is insufficient to induce gene editing at the indel frequencies in cultured human cells reported in the original study。”）

　　和之前發表在Protein Cell的論文一樣，這一論文是對于韓論文的嚴格的重復實驗。文章中確定了gDNA的5’磷酸化，gDNA和NgAgo表達質粒的有效轉染，所以只剩下非常有限的變量來解釋無法重復的原因了。避免細胞污染是這些實驗室的基本操作規范，所以用污染來解釋也是非常牽強的。而分布在世界各地的實驗室都發生了細胞污染導致實驗失敗的可能性幾乎為“0”。發表在Protein Cell和NBT的這兩篇文章都得出了同樣的結論，即按照韓論文中的條件無法得到NgAgo有效編輯內源基因的結果。

　　在NBT的“編輯部關注”中提到韓春雨和沈嘯同意雜志就這一爭議發表論文，那么希望他們能夠以真正正面、積極、科學的態度來配合調查，盡快給出一個客觀的解釋，澄清事實。

　　（本文根據NBT發表的論文“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”翻譯整理）